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題目：
異質(zhì)細(xì)胞間耦合在心臟的機(jī)械和電信號傳輸中起著重要作用。盡管許多研究已經(jīng)研究了心肌組織內(nèi)肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的電信號傳導(dǎo)，但研究機(jī)械對應(yīng)物的研究并不多。本研究旨在研究在健康和心臟病發(fā)作模擬基質(zhì)僵硬條件下，底物硬度和心肌成纖維細(xì)胞（CMF）的存在對心肌細(xì)胞（CMs）和CMFs機(jī)械力傳播的影響。使用與熒光顯微鏡集成的生物納米壓痕儀測量CM產(chǎn)生的收縮力及其在CMF中的傳播，以實(shí)現(xiàn)快速鈣成像。我們的結(jié)果表明，較軟的基質(zhì)有助于更強(qiáng)和更進(jìn)一步的信號傳輸。有趣的是，CMF的存在以剛度依賴的方式衰減了信號傳播。與具有CMF的軟基質(zhì)相比，存在CMF的較硬基質(zhì)使信號衰減約24-32%，表明心肌梗死后基質(zhì)剛度增加和CMF數(shù)量增加對心肌功能具有協(xié)同不利影響。此外，CMF運(yùn)動在CM-CMF邊界處的跳動模式也取決于基板剛度，從而影響CM產(chǎn)生的收縮力的傳播波形。我們進(jìn)行了計(jì)算機(jī)模擬，以進(jìn)一步了解不同力傳遞模式的發(fā)生，并表明在CM-CMF界面處組裝的細(xì)胞-基質(zhì)粘附（根據(jù)基板剛度而不同）在決定信號傳輸?shù)男屎蜋C(jī)制方面起著重要作用。總之，除了底物剛度外，受底物剛度影響的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的程度和類型也會影響心肌組織中肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞之間的機(jī)械信號傳導(dǎo)。
使用Piuma Chiaro納米壓痕系統(tǒng)（Optics11，荷蘭阿姆斯特丹）（26）測試天然心臟組織塊，具有不同剛度的PDMS底物以及PDMS底物上培養(yǎng)的CMF細(xì)胞的硬度。
使用直徑為90 μm的膠體探針測試具有不同剛度的PDMS基板。用于軟基板的壓痕探頭的彈簧常數(shù)為0.43 N/m，而用于中等和剛性基板的探頭的彈簧常數(shù)為4.21 N/m。針對每個(gè)PDMS底物條件測試了三個(gè)單獨(dú)的樣品，并從每個(gè)樣品的不同位置記錄了多個(gè)測量值。所有樣品共記錄了204-390個(gè)壓痕數(shù)據(jù)點(diǎn)。
用于在PDMS襯底上接種的CMF的壓痕探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別約為0.045 N / m和41 μm。針對每種底物類型，在兩個(gè)獨(dú)立樣品上總共測試了45種不同的CMF細(xì)胞。在測試之前，懸臂的靈敏度校準(zhǔn)是通過壓痕硬表面（即載玻片）進(jìn)行的。使用的加載速度分別為 50、2 和 0.2 μm/s。開發(fā)了一個(gè)定制的MATLAB代碼（The MathWorks，Natick，MA），以確定探針和樣品之間的接觸點(diǎn)，并使用赫茲接觸模型（27，33）識別樣品的楊氏模量：(1)其中F是施加的力，δ是壓痕深度，R是膠體探針的半徑，E是樣品的楊氏模量。假設(shè)樣品是不可壓縮的（即泊松比為0.5），因?yàn)槭褂迷撃Ｐ偷奈墨I(xiàn)研究得出的結(jié)論是，當(dāng)泊松比從20.0到3.0（5）變化時(shí)，測量的性質(zhì)變化小于34%，因此，假設(shè)大多數(shù)生物樣品的不可壓縮性是合理的（35，36).使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以95%置信水平報(bào)告統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p < 0.05）。
通過駐留實(shí)驗(yàn)（23）用納米壓痕儀測量細(xì)胞片內(nèi)單個(gè)CM和CMF的收縮力。簡而言之，將納米壓痕探針與樣品接觸，并且探針的位移保持恒定（換句話說，探針駐留在樣品上）30秒以動態(tài)測量其偏轉(zhuǎn)，這與電池沿橫向相對于基板的收縮力成正比。
首先，我們測量了共培養(yǎng)樣品上與CM-CMF邊界相鄰的單個(gè)CM的收縮力，以及沒有任何CMF的對照樣品上CM-PDMS邊界處的CM。然后，依次測量單個(gè)CMF的收縮力，每次在距邊界更遠(yuǎn)的距離處測量，如圖1 A所示，直到?jīng)]有可檢測到的信號。所有跳動力測量均在細(xì)胞核上進(jìn)行，以確保一致性，并盡量減少細(xì)胞剛度異質(zhì)性的影響。每次測量后，懸臂沿X軸移動，并在最近的CMF上進(jìn)行測量。因此，所有測量都是在距邊界相似的距離處進(jìn)行的，根據(jù)最近CMF的確切位置，差異僅為～5-10%。所用探頭的彈簧常數(shù)和直徑分別為0.067 N/m和5.4 μm。開發(fā)了定制的 MATLAB 代碼來分離每個(gè)單拍并計(jì)算平均收縮力。
為了開發(fā)本研究中的FEA模型，通過圖像分析和納米壓痕測量測量了CMF的尺寸（即細(xì)胞直徑和高度）。首先，我們通過測量新附著的球形CMF的直徑和高度來計(jì)算單個(gè)CMF的體積，該CMF在細(xì)胞接種后不超過15分鐘接種在培養(yǎng)皿上，以確保細(xì)胞仍呈球形。簡而言之，捕獲了這些球形細(xì)胞的明場圖像，并通過使用ImageJ繪制兩條從細(xì)胞中心穿過的對角線來測量直徑，以獲得D0.然后，這些球形細(xì)胞的高度，H0，通過使用納米壓痕儀壓進(jìn)細(xì)胞及其旁邊的基板并記錄細(xì)胞-基底接觸點(diǎn)（33）來測量。這些尺寸用于計(jì)算細(xì)胞的體積V0如下：
最后，我們測量了在不同剛度基材上播種并鋪展的CMF的高度。由于擴(kuò)散的CMF的不規(guī)則形狀，我們假設(shè)細(xì)胞體積被保留，而不管細(xì)胞的形狀調(diào)制，同時(shí)擴(kuò)散（37，38）?；谶@一假設(shè)并使用第 V 卷0并測量了不同剛度基板上展開的CMF的CMF高度H，我們使用以下公式計(jì)算了不同PDMS基板上CMF的直徑D：
首先，我們通過納米壓痕實(shí)驗(yàn)研究了天然組織基質(zhì)、具有不同剛度的制備PDMS底物以及在這些基質(zhì)上接種的CMFs的粘彈性。我們觀察到不同PDMS基板的測量剛度的變化取決于壓痕的加載速度。PDMS基板剛度是在三種不同的加載速度（即50、2和0.2 μm/s）下測量的，如圖1 B所示。當(dāng)加載速度從50 m/s降低到2 μ m/s和從2 μm/s（p < 0.2）降低時(shí)，基體的剛度顯著降低，但軟基體的剛度從0 m/s降低到0001 μm/s（p = 50.2）時(shí)除外。同樣，在不同PDMS襯底上晶種的CMF表現(xiàn)出加載速度依賴性剛度（p <0.1484），當(dāng)加載速度從0 m/s降低到005.2 μm/s（p = 0.2）時(shí)，在中等襯底上接種的CMF除外（圖0 C）。為了進(jìn)行比較，測量了天然大鼠心臟組織的硬度，該硬度也隨著加載速度從1924降低到1.50 μm / s（p < 0.2）而降低。
PDMS襯底和在PDMS襯底上晶種的CMF均表現(xiàn)出應(yīng)變速率依賴性剛度。軟底物剛度約為13.9-17.66 kPa，與天然健康心臟組織的硬度相似（即11.33-18.46 kPa （6）），因?yàn)槲覀儨y量的健康成年大鼠心臟為13.32±8.60 kPa，而中度和僵硬底物的硬度分別為83.29-105.71和483.92-529.63 kPa，與早期研究中測量的梗死心臟組織的硬度相當(dāng)（4， 5）. 同樣，在軟、中和硬基底上接種的 CMF 的剛度分別為 0.95–3.02、2.06–4.96 和 1.61–5.47 kPa?？梢钥闯?，正如預(yù)期的那樣，電池剛度隨著基板剛度的增加而增加（44）。這種加載速度依賴性剛度與先前在組織和細(xì)胞（上的發(fā)現(xiàn)一致33，45）。
Piuma是功能強(qiáng)大的臺式儀器，可探索水凝膠、生理組織和生物工程材料的微觀機(jī)械特性。表征尺度從宏觀直至細(xì)胞。專為分析測試軟材料而設(shè)計(jì)，測量復(fù)雜和不規(guī)則材料在生理?xiàng)l件下的力學(xué)性能。杭州軒轅科技有限公司
● 內(nèi)置攝像鏡頭，方便實(shí)時(shí)觀察樣品臺
● 實(shí)時(shí)分析計(jì)算測量結(jié)果，原始數(shù)據(jù)并將以文本文件存儲，方便任何時(shí)候?qū)隓ataviewer軟件進(jìn)行復(fù)雜處理
● 探針經(jīng)過預(yù)先校準(zhǔn)，即插即用。對于時(shí)間敏感的樣品確保了快速測量
● 光纖干涉MEMS技術(shù)能夠以無損的方式測量即使是最軟的材料，并保證分辨率。同時(shí)探針可以重復(fù)使用Piuma軒轅納米壓痕儀Piuma軒轅納米壓痕儀
| 模量測試范圍 | 5 Pa - 1 GPa |
| 探頭懸臂剛度 | 0.025 - 200 N/m |
| 探頭尺寸(半徑) | 3 - 250 μm |
| 最大壓痕深度 | 100 μm |
| 傳感器最大容量 | 200 |
| 測試環(huán)境 | air, liquid (buffer/medium) |
| 粗調(diào)行程 | X*Y：12×12 mm Z：12 mm |
加載模式 | Displacement / Load* / Indentation* |
| 測試類型 | 準(zhǔn)靜態(tài)(單點(diǎn)，矩陣) 蠕變，應(yīng)力松弛 DMA動態(tài)掃描 (E', E'', tanδ) |
| 動態(tài)掃描頻率* | 0.1 - 10 Hz |
| 內(nèi)置擬合模型 | Young's Modulus (Hertz / Oliver-Pharr / JKR) |
| *為可選升級配置 | |
新型光纖干涉式懸臂梁探頭，利用干涉儀來監(jiān)測懸臂梁形變。
創(chuàng)新型光纖探頭，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)納米壓痕儀無法測試軟物質(zhì)的問題，也解決了AFM在力學(xué)測試中的波動大，操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見缺陷。
● 背景噪音低：激光干涉儀抗干擾強(qiáng)于AFM反射光路
● 制樣更簡單：對樣品的粗糙度寬容度高于AFM
● 剛度選擇更準(zhǔn)確：平行懸臂梁結(jié)構(gòu)有利于準(zhǔn)確判別壓痕深度與壓電陶瓷位移比例關(guān)系，便于選擇合適剛度探頭來保證彈性形變關(guān)系的穩(wěn)定性，進(jìn)而獲得重復(fù)率更高、準(zhǔn)確性更好的數(shù)據(jù)
● 借助功能強(qiáng)大而易于操作的軟件，用戶可以自由控制壓痕程序（載荷、位移等）。自動處理曲線的流程，可以獲得數(shù)據(jù)和結(jié)果的快速分析
● 原始參數(shù)完整txt導(dǎo)出，便于后續(xù)復(fù)雜處理的需要
● 利用Hertz接觸模型從加載部分計(jì)算彈性模量，與常用的Oliver&Pharr方法相比，更為適合生物組織和軟物質(zhì)材料特性
| 年 份 | 期 刊 | 題 目 |
|---|---|---|
| 2022 | Advanced Functional Materials | Engineering Vascular Self-Assembly by Controlled 3D-Printed Cell Placement |
| 2022 | Biomaterials | Hydrogels derived from decellularized liver tissue support the growth and differentiation of cholangiocyte organoids |
| 2021 | Biofabrication | 3D bioprinting of tissue units with mesenchymal stem cells, retaining their proliferative and differentiating potential, in polyphosphate-containing bio-ink |
| 2021 | nature communications | Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration |
| 2020 | Environmental Science & Technology | Effect of Nonphosphorus Corrosion Inhibitors on Biofilm Pore Structure and Mechanical Properties |
| 2020 | Acta Biomaterialia | A multilayer micromechanical elastic modulus measuring method in ex vivo human aneurysmal abdominal aortas |
